NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS CLÁSICAS BCR-ABL NEGATIVAS

Las Neoplasias mieloproliferativas crónicas clásicas BCR-ABL negativas (NMPCC) constituyen un grupo heterogéneo de patologías que incluyen: policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (MFP). Se caracterizan por presentar mieloproliferación clonal derivada de la célula madre hematopoyética que provoca un aumento de células maduras en sangre periférica (SP); y por presentar mutaciones drivers mutuamente excluyentes en: JAK2 (Janus kinase 2), CALR (calreticulina) y MPL (oncogén del virus de la leucemia mieloproliferativa)

 

POLICITEMIA VERA (PV)

La PV es una neoplasia de células progenitoras hematopoyéticas, con una proliferación celular trilineal, predominantemente de células progenitoras eritroides, con aumento de hematíes circulantes. Cursa generalmente con hemoglobina (Hb) y hematocrito (Hto) elevados en forma persistente, leucocitosis, trombocitosis, esplenomegalia, hepatomegalia y otros focos de hematopoyesis extramedular (HEM).

 

CITOGENÉTICA MOLECULAR FISH:

  • Reordenamiento BCR::ABL1 t(9;22)(q34;q11.2)

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA o Heparina

 

BIOLOGÍA MOLECULAR:

Mutaciones drivers

  • Mutación puntual JAK-2(V617F) Exón 14    

El JAK2 (9p24) codifica una tirosina quinasa fundamental para la transducción de señales de múltiples receptores de factores hematopoyéticos de crecimiento.  Las mutaciones en JAK2 fueron las primeras en describirse asociadas a las NMP y resultan en la activación constitutiva de la proteína quinasa JAK2 y las vías de señalización en las que participa.

La mutación V617F se registra en aproximadamente el 96% en PV, y en TE y MFP, (incluida la preMFP) con frecuencias mutacionales del 55% y 65%, respectivamente.

El estudio de la presencia de la mutación V617F mediante real time PCR con sonda TaqMan, ensayo de genotipificación del polimorfismo de nucleótido único permite además cuantificar la carga alélica de la mutación.

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

  • Mutaciones en JAK-2 (Exón 12) 

Las mutaciones adquiridas dirigidas al exón 12 del gen JAK2 se han registrado en la mayor parte de los pacientes con diagnóstico de PV que no portan la mutación puntual en el exón 14 del gen JAK2, JAK2 V617F. Dichas mutaciones afectan una región adyacente al inicio del dominio pseudo-quinasa (residuos 536 al 547) e incluyen sustituciones, deleciones y duplicaciones.

Para el estudio se realiza una PCR del exón 12 del gen JAK2, seguido de secuenciación directa (técnica de Sanger) del producto amplificado. 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

 

LABORATORIO DE RUTINA: 

EPO. 

Muestra: Suero

TROMBOCITEMIA ESENCIAL (TE)

La trombocitemia esencial (TE) es una neoplasia mieloproliferativa crónica que involucra principalmente a la línea megacariocítica en médula ósea. Se caracteriza por trombocitosis sostenida (recuento de plaquetas: ≥ 450 x 109 / L) en la sangre periférica e hiperplasia megacariocítica, en ausencia de eritrocitosis o leucoeritroblastosis.

Tiene un curso clínico relativamente benigno, con mayor frecuencia de complicaciones trombóticas y / o hemorragia.

Para su diagnóstico deben excluirse otras causas de trombocitosis incluyendo otros tipos de NMP, trastornos inflamatorios infecciosos, hemorragias, etc.

 

CITOMETRÍA DE FLUJO MULTIPARAMÉTRICA: Inmunofenotipo

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA o heparina de sodio

 

ESTUDIO CITOGENÉTICO (CTG): Cariotipo con bandeo G 

Muestra: Médula Ósea anticoagulada con heparina de sodio

 

CITOGENÉTICA MOLECULAR FISH:    

  • Reordenamiento BCR::ABL1 t(9;22)(q34;q11.2)

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoagulada con EDTA o heparina de sodio

 

BIOLOGÍA MOLECULAR:

Mutaciones drivers

  • Mutación puntual V617F de JAK-2 (exón 14):        

El JAK2 (9p24) codifica una tirosina quinasa fundamental para la transducción de señales de múltiples receptores de factores hematopoyéticos de crecimiento.  Las mutaciones en JAK2 fueron las primeras en describirse asociadas a las NMP y resultan en la activación constitutiva de la proteína quinasa JAK2 y las vías de señalización en las que participa.

La mutación V617F se registra en aproximadamente el 96% en PV, y en TE y MFP, (incluida la preMFP) con frecuencias mutacionales del 55% y 65%; respectivamente.

El estudio de la presencia de la mutación V617F mediante real time PCR con sonda TaqMan, ensayo de genotipificación de polimorfismo de nucleótido único permite además cuantificar la carga alélica de la mutación.

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

  • Inserciones/ deleciones en el exón 9 de CALR:

El descubrimiento en el año 2013 de mutaciones en el gen CALR (19p13.2) ha representado un gran avance en el diagnóstico molecular de las NMP. En la literatura actual, se describen mutaciones en CALR en el 15-32% de pacientes con TE y en el 25-35% de aquellos con MFP, y raramente se encuentran en PV.

La proteína codificada por dicho gen es una chaperona de unión multifuncional al Ca2+, localizada principalmente en el retículo endoplásmico. Si bien se han descrito más de 50 mutaciones diferentes en el exón 9 del gen CALR, las más frecuentes son latipo 1 (c.1092_1143del) y la tipo 2 (c.1154_1155insTTGTC) que pueden evidenciarse mediante PCR y análisis de fragmentos. 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

  • Mutaciones en el exón 9 de MPL:

El gen MPL (oncogén del virus de la leucemia mieloproliferativa) (1p34) codifica el receptor de la trombopoyetina que regula la producción de plaquetas y progenitores hematopoyéticos. Las mutaciones en MPL, ocurren aproximadamente, en el 4% de los pacientes con TE, en el 8% de los pacientes con MFP y rara vez en PV. Si bien las mutaciones registradas se agrupan en el exón 10, las más frecuentes son MPLW515L/K. La presencia de alguna de estas alteraciones conduce a la activación del receptor en ausencia de trombopoyetina, generando una activación constitutiva de la vía de señalización JAK-STAT.

Para el estudio de las mismas, se realiza una PCR del exón 10 del gen MPL, seguido de secuenciación directa (técnica de Sanger) del producto amplificado. 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

Mutaciones complementarias

Las mutaciones complementarias asociadas con mecanismos epigenéticos (ASXL1, EZH2, IDH1/2, TET2) y con el splicing del ARN (SRSF2, U2AF1) se asocian a pronóstico desfavorable en términos de sobrevida global y sobrevida libre de leucemia independientemente de la categoría del score pronóstico utilizado. La evaluación de dichas mutaciones, consideradas de alto riesgo molecular (ARM) permite estratificar al paciente sobre todo aquellos con diagnóstico de MF y así adaptar las decisiones terapéuticas, especialmente en relación al trasplante. Dentro del grupo que no presentan mutaciones drivers (triples negativos), según las recomendaciones de la European LeukemiaNet (ELN), la búsqueda de dichas mutaciones permite demostrar la naturaleza clonal de la enfermedad.

  • ASXL1
  • IDH1/IDH2
  • SRSF2
  • EZH2
  • TET2
  • SF3B1

 

  • NGS (next-generation sequencing) Panel mieloide por captura híbrida

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

 

LABORATORIO DE RUTINA: 

  • EPO
  • LDH

Muestra: Suero

MIELOFIBROSIS PRIMARIA (MFP)

La Mielofibrosis Primaria (MFP) es una neoplasia mieloproliferativa crónica caracterizada por fibrosis progresiva de la médula ósea (MO) y el desarrollo de hematopoyesis extramedular (HEM). Clásicamente evoluciona en etapas iniciando con una etapa proliferativa llegando al cuadro característico de anemia progresiva con hematíes en lágrima o dacriocitos, elementos inmaduros mieloides y eritroides (leucoeritroblastosis) en sangre periférica (SP). En la evolución los pacientes pueden presentar esplenomegalia, fatiga, dolor óseo, sudoración nocturna y pérdida de peso, con reducción de la calidad de vida y sobrevida acortada, en algunos casos con transformación leucémica.

 

DIAGNÓSTICO

CITOMETRÍA DE FLUJO MULTIPARAMÉTRICA: Inmunofenotipo

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA o heparina de sodio

 

ESTUDIO CITOGENÉTICO (CTG): cariotipo con bandeo G 

Muestra: Médula Ósea anticoaguladas con heparina de sodio

 

CITOGENÉTICA MOLECULAR FISH:    

  • Reordenamiento BCR::ABL1 t(9;22)(q34;q11.2)

 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA o heparina de sodio

 

BIOLOGÍA MOLECULAR:

Mutaciones drivers

  • Mutación puntual V617F de JAK-2 (exón 14):        

El JAK2 (9p24) codifica una tirosina quinasa fundamental para la transducción de señales de múltiples receptores de factores hematopoyéticos de crecimiento.  Las mutaciones en JAK2 fueron las primeras en describirse asociadas a las NMP y resultan en la activación constitutiva de la proteína quinasa JAK2 y las vías de señalización en las que participa.

La mutación V617F se registra en aproximadamente el 96% en PV, y en TE y MFP, (incluida la preMFP) con frecuencias mutacionales del 55% y 65%, respectivamente.

El estudio de la presencia de la mutación V617F mediante real time PCR con sonda TaqMan, ensayo de genotipificación del polimorfismo de nucleótido único permite además cuantificar la carga alélica de la mutación.

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

  • Inserciones/ deleciones en el exón 9 de CALR:

El descubrimiento en el año 2013 de mutaciones en el gen CALR (19p13.2) ha representado un gran avance en el diagnóstico molecular de las NMP. En la literatura actual se describen mutaciones en CALR en el 15-32% de pacientes con TE y en el 25-35% de aquellos con MFP, y raramente se encuentran en PV.

La proteína codificada por dicho gen es una chaperona de unión multifuncional al Ca2+, localizada principalmente en el retículo endoplásmico. Si bien se han descrito más de 50 mutaciones diferentes en el exón 9 del gen CALR, las más frecuentes son la tipo 1 (c.1092_1143del) y la tipo 2 (c.1154_1155insTTGTC) que pueden evidenciarse mediante PCR y análisis de fragmentos. 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

  • Mutaciones en el exón 9 de MPL:

El gen MPL (oncogén del virus de la leucemia mieloproliferativa) (1p34) codifica el receptor de la trombopoyetina que regula la producción de plaquetas y progenitores hematopoyéticos. Las mutaciones en MPL, ocurren aproximadamente, en el 4% de los pacientes con TE, en el 8% de los pacientes con MFP y rara vez en PV. Si bien las mutaciones registradas se agrupan en el exón 10, las más frecuentes son MPLW515L/K. La presencia de alguna de estas alteraciones conduce a la activación del receptor en ausencia de trombopoyetina, generando una activación constitutiva de la vía de señalización JAK-STAT.

Para el estudio de las mismas, se realiza una PCR del exón 10 del gen MPL, seguido de secuenciación directa (técnica de Sanger) del producto amplificado. 

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

Mutaciones Complementarias

Las mutaciones complementarias asociadas con mecanismos epigenéticos (ASXL1, EZH2, IDH1/2, TET2) y con el splicing del ARN (SRSF2, U2AF1) se asocian a pronóstico desfavorable en términos de sobrevida global y sobrevida libre de leucemia independientemente de la categoría del score pronóstico utilizado. La evaluación de dichas mutaciones, consideradas de alto riesgo molecular (ARM) permite estratificar al paciente especialmente aquellos con diagnóstico de MF y así adaptar las decisiones terapéuticas, especialmente en relación al trasplante. Dentro del grupo que no presentan mutaciones drivers (triples negativos), según las recomendaciones de la European LeukemiaNet (ELN), la búsqueda de dichas mutaciones permite demostrar la naturaleza clonal de la enfermedad.

  • ASXL1
  • IDH1/IDH2
  • SRSF2
  • EZH2
  • TET2
  • SF3B1
  • NGS (next-generation sequencing) Panel mieloide por captura híbrida

Muestra: Sangre Periférica/ Médula Ósea anticoaguladas con EDTA

LABORATORIO DE RUTINA: 

-EPO

-LDH

Muestra: Suero